五神汤的成分分析：了解每一分的化学力量

五神汤源自清代陈士铎的《洞天奥旨·皮肤痈》篇[1]，主要用于防治湿热蕴蒸而致的多皮肤痈，处方由金银花、牛膝、车前子、茯苓和紫花地丁五味药组成，均收录于《中国药典》一部2020年版。《辨证录》中记载“茯苓、车前子以利水，紫花地丁以清热，又用金银花、牛膝补中散毒。”全方五药以清热、利湿、散毒为主，是治疗皮肤痈的经典方剂[2-4]。

超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱-质谱（UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS/MS）联用技术能精确、快速地对初级和次级代谢产物进行分析，因此普遍应用于复杂的中药化学成分体系分析中[5-7]。本研究拟采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS/MS技术对五神汤提取液中的化合物进行系统分析，并结合现有报道对化合物的质谱裂解规律进行分类和总结[8-10]。为后续五神汤的药效物质基础研究提供理论和数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Scientific™Q Exactive™质谱仪和Dionex Ultimate 3000 RSLC液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；MS105DU型十万分之一电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；BSM－120.4万分之一电子天平（上海卓精电子科技有限公司）；DZTW型加热套、RE-52AA型旋转蒸发仪（上海力辰邦西仪器有限公司）；DHG-9080A型鼓风干燥箱（上海博珍仪器设备制造厂）。

1.2 药材与试剂

金银花（批号220720，产地河南）、紫花地丁（批号201225，产地河北）、茯苓（批号22122802，产地安徽）、车前子（批号220737，产地江西）及牛膝（批号22011701，产地河北）均购自北京同仁堂药房；芦丁（批号FY00B4067）、没食子酸（批号PS000518）、原儿茶酸（批号PS012560）、奎尼酸（批号PS001245）、杨梅素（批号PS001011）、京尼平苷酸（批号PS000518）、咖啡酸（批号PU1191-0025）对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司，质量分数均≥98%；木犀草苷（批号FY1466B7017）、绿原酸（批号FY1435B516）、槲皮素（批号FY160B7158）、秦皮乙素（批号FY00B5112）、秦皮甲素（批号FY00B4067）、毛蕊花糖苷（批号FY1624B0602）、β-蜕皮甾酮（批号FY00B5006）对照品均购自南通飞宇生物科技有限公司，质量分数均≥98%；甲醇和乙腈（HPLC 级）均购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

2 方‏法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取芦丁、没食子酸、原儿茶酸、奎尼酸、杨梅素、京尼平苷酸、咖啡酸、木犀草苷、绿原酸、槲皮素、秦皮乙素、秦皮甲素、毛蕊花糖苷、β-蜕皮甾酮对照品适量，置于棕色量瓶中，用80%的甲醇溶解稀释，并定容至25 mL，制备成200 μg/mL的对照品储备液，取各对照品储备液适量，稀释成约5 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 五神汤各味药材粉碎，过60目筛，按处方配比称取五神汤药材粉末39 g，加入25倍量水，浸泡60 min，提取105 min，加热回流提取3次，合并续滤液，减压浓缩（60 ℃）至250 mL。精密移取0.5 mL浓缩液，置于10 mL量瓶中，用蒸馏水稀释并定容至刻度，摇匀，即得五神汤供试品溶液（7.8 mg/mL）。

2.2 色谱‪和质谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱为 ShiM-pack XR-ODS C18 柱（75 mm×3.0 mm，2.2 μm）；流动相：乙腈（B）-水（A）；体积流量0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱程序：0.01～4 min，2%～8% B；4～5 min，8%～10% B；5～9 min，10%～17% B；9～12 min，17%～20% B；12～16 min，20%～23% B；16～16.5 min，23%～2% B。

2‫.2.2 质谱条件 HESI-II离子源，正、负离子模式；离子源温度550 ℃；气帘气（CUR）：206.84 kPa；雾化气（gas1）和辅助气（gas2）为高纯度氮气，均为379.21 kPa；一级质谱母离子扫描范围m/z 50～900，二级质谱扫描范围为m/z 50～800；扫描时间为21 min。

2.3 构建化学成分数据库

结合课题组前期研究[11-12]，以及文献报道的关于金银花、紫花地丁、茯苓、车前子及牛膝中已明确的化学成分，进行数据整理，建立包括化合物的名称、分子式、相对分子质量、碎片离子等信息的“五神汤化学成分数据库”。

2.4 结果

将采集的高分辨液质数据通过 Xcalibur 定性筛查软件，结合 Massbank 等数据库，对比化合物一级、二级质谱信息等对化合物进行确认。共分析比对出五神汤提取液中95个化合物，总离子流图见图1，五神汤化学成分信息详见表1。其中包括27个黄酮类化合物，15个酚酸类化合物，11个环烯醚萜类化合物、5个香豆素类化合物、5个生物碱类化合物、4个苯乙醇苷类化合物以及其他类化合物。

2.4.1 黄酮类成分的鉴定分析 正、负离子模式下共鉴定出黄酮类化合物27种，主要来自于金银花和紫花地丁。其中，以黄酮糖苷类化合物居多，裂解规律以糖苷键断裂的情形较为普遍[13]，例如化合物中常失去1分子葡萄糖残基、鼠李糖或木糖后，自身结构会转变为黄酮苷元结构，在二级裂解过程中，化合物自身的CO、CO2及其邻位-OH也易于丢失。

以化合物75（tR＝13.71 min）和65（tR＝12.75 min）为例，在负离子模式下，其准分子离子峰分别为C21H19O11（m/z447.093 02 [M－H]−）、C21H19O12（m/z463.087 77 [M－H]−），在ESI−二级质谱碎片峰中可以观察到m/z 284.032 68 [M－H－C6H10O5]−、m/z⁤ 300.027 50 [M－H－C6H10O5]−是由准分子离子峰失去葡萄糖残基所产生，m/z 284.032 68 [M－H－C6H10O5]−继续以RDA裂解的方式产生碎片m/z 153.093 28 [M－H－C8H4O2]−，同时失去1分子CO产生m/z 271.024 90 [M－H－CO]−碎片离子，用msaabank数据库及文献报道[14-15]进行比对，推测化合物分别为木犀草苷和金丝桃苷，二级质谱图见图2，裂解规律见图3。

2.4.2 酚酸类成分的鉴定分析 鉴定出的酚酸类成分主要来自于五神汤中的金银花，包括绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、柠檬酸等。该类化合物在负离子模式下有较好的响应，且在二级裂解过程中易丢失H2O和-COOH。

以化合物25为例（tR＝7.06 min），在负离子模式下，其准分子离子峰C16H18O9（m/z 353.087 13 [M－H]−），在二级碎片质谱峰中产生m/z 179.035 06 [M－H－C6H10O5]−和m/z135.045 21 [M－H－CO2]−碎片离子，分别为丢失1分子的葡萄糖残基-C6H10O5和失去1分子CO2产生；并同时以m/z 191.056 14 [M－H－C9H6O3]−碎片离子的形式存在，结合对照品以及文献数据报道[16]，推测其为绿原酸，二级质谱图见图2，裂解规律见图4。

2.4.3 环烯醚萜类类化合物的鉴定分析 鉴定出的环烯醚萜类化合物主要来自于五神汤中的金银花和车前子，包括马钱苷酸、京尼平苷酸、栀子苷、桃叶珊瑚苷等。该类化合物中包含基团较多，如葡萄糖基团、芹菜基团等，容易和糖类成分结合形成苷元结构，在二级裂解过程中也易丢失葡萄糖残基、-OH和-COOH等结构，形成大量的碎片离子。

以化合物17（tR＝7.25 min）和29（tR＝5.36 min）为例，在负离子模式下，其准分子离子峰C16H21O10（m/z 373.113 40 [M－H]−）、C16H23O10（m/‫z 375.128 97 [M－H]−），分别产生m/z 193.050 51 [M－H－C6H10O5]−、m/z149.060 56 [M－H－COOH]−和m/z195.066 50 [M－H－C6H10O5]−、m/‌z151.076 48 [M－H－COOH]−、m/z121.066 02 [M－H－OH－CH3]−二级碎片离子，推测17号化合物为丢失1分子的葡萄糖残基-C6H10O5和失去1分子-COOH；推测29号丢失1分子的葡萄糖残基-C6H10O5后，继而失去1分子-COOH以及-CH3和-OH产生的碎片离子。结合Msaabank数据库及相关文献[17]，推测其为京尼平苷酸和马钱苷酸，二级质谱图见图2，裂解规律见图5。

2.4.4 苯乙醇苷类化合物的鉴定分析 鉴定出的萜类化合物主要来自于五神汤中的车前子，包括马钱苷酸、京尼平苷酸、栀子苷、桃叶珊瑚苷等。该类化合物中包含基团较多，如葡萄糖基团、芹菜基团等，容易和糖类成分结合形成苷元结构，在二级裂解过程中也易丢失葡萄糖残基、-OH和-COOH等结构，形成大量的碎片离子。

以化合物24（tR＝8.03 min）和68（tR＝12.9 min）为例，在负离子模式下，其准分子离子峰C29H35O15（m/z623.197 94 [M－H]−），在二级碎片质谱峰中观察到m/z 461.165 65 [M－H－C6H10O4]−，是由糖苷断裂失去一分子鼠李糖产生，同时酯键断裂生成m/z 315.108 86 [M－H－C8H8O2]−碎片离子，再失去1分子葡萄糖生成碎片m/z 161.024 41 [M－H－C6H10O5]−，最终脱羧基产生碎片离子m/‎z133.029 56 [M－H－COOH]−。根据文献报道[18]，推测化合物为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷，二级质谱图见图2，裂解规律见图6。

2.4.5 香豆素类化合物的鉴定分析 五神汤中鉴定出的香豆素成分主要来自于紫花地丁，包括秦皮乙素、秦皮甲素、甲氧基香豆素等。香豆素类化合物的裂解规则为在CID裂解中易发生开环，在二级质谱裂解中母离子容易丢失中性分子，侧链丢失其他基团。这种裂解方式是香豆素类化合物的特征裂解规则。由此，推测14号化合物为秦皮甲素，二级质谱图见图2，裂解规律见图7。

2.4.6 生物碱类化合物的鉴定分析 鉴定出的生物碱化合物主要来自于五神汤中的车前子，包括甜菜碱、表小檗碱、黄连碱、尿囊素等。生物碱大多以正离子的形式存在，因此，在正负离子扫描模式下，正离子下的响应更好。在二级质谱分析时，该类化合物断裂以N+为中心进行裂解，如-CH3、-C4H8等，造成多甲基的丢失，形成大量的碎片离子。

2.4.7 其他类化合物 液质鉴定出五神汤中含有许多种化合物，除了以上类型的化合物外，还有脂肪酸、脂肪酯类、甾酮类以及挥发油类物质等。脂肪酸及脂肪酯类包含油酸、亚油酸、月桂酸、棕榈酸乙酯、亚麻酸乙酯等；甾酮类包含β-蜕皮甾酮和牛膝甾酮，是牛膝中的主要化学成分；挥发油类包括α-松油醇、芳樟醇等。

3 讨论

3.1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS/MS条件优⁤化

五神汤处方由金银花、紫花地丁、茯苓、牛膝和车前子5味药材组成。由于中药复方中的成分较为复杂，将各组分快速分离分析，难度较大，因此对流动相系统的考察和确定显得尤为重要。本实验前期对甲醇-水、乙腈-水不同配比的流动相系统以及加入不同比例的甲酸（0.1%～0.5%）进行考察，发现“乙腈-水”系统的峰容量较多且具有更高的分离度和灵敏度，同时明显缩短分析时间。因此，最终选择“乙腈-水”作为流动相。对LC的不同体积流量（0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min）和不同柱温（25、30、35和40 ℃）进行了考察，结果表明，体积流量为0.5 mL/min，柱温为30 ℃时，待测物峰形较好，分离度高。

3.2 五神汤主要化学成分研究

建立的UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS/MS分析方法快速、准确地从五神汤中分析鉴定出95个化合物，包括27个黄酮类、15个酚酸类、11个环烯

醚萜类、5个香豆素类、5个生物碱类、4个苯乙醇苷类以及其他类化合物。其中，基于对照品的色谱峰与质谱数据，准确鉴定了17个化合物，包括8个酚酸类化合物（没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸、奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C）、4个黄酮类化合物（槲皮素、芦丁、木犀草苷、杨梅素）、2个香豆素类化合物（秦皮甲素和秦皮乙素）、1个环烯醚萜类化合物（京尼平苷酸）、1个苯乙醇苷类化合物（毛蕊花糖苷）和1个甾体类化合物（β-蜕皮甾酮）。通过与天然化合物数据库、massbank等数据库的分子离子、二级碎片离子比对，并参考相关文献，推测出其他78个化合物。

本研究采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS/MS联用技术对中药复方五神汤水提液中的化合物进行系统分析，共分析鉴定出95个化合物，结果表明，黄酮类和酚酸类化合物为五神汤的最主要化学成分，且据文献报道，具有较好的抗炎、抗氧化活性。以上结果表明了五神汤主要化学成分的鉴定与归属，从化学角度展示了五神汤的物质基础，为今后五神汤的药效学研究奠定了基础。

来 源：张 敏，朱先宏，石 芸，秦昆明，高 珣．五神汤中化学成分研究 [J]. 中草药, 2024, 55(18): 6131-6143.